大鼠载脂蛋白B100试剂盒：原理、性能与精准实验指南

在代谢综合征、动脉粥样硬化及新型调脂药物的研究中，大鼠是模式生物之一。然而，大鼠血清中载脂蛋白B100（ApoB100）的浓度仅为人类的大约1/10，且与ApoB48、ApoE等同源蛋白的序列相似度高达70%以上，对检测工具的特异性提出了要求。近年来，随着双抗体夹心ELISA技术的成熟，专为啮齿类设计的“大鼠载脂蛋白B100试剂盒”应运而生，成为连接基础脂质代谢研究与临床前药效评价的桥梁。本文结合2025年市面主流产品数据，系统阐述其技术原理、性能指标、操作流程及关键注意事项，为科研工作者提供一份可落地的实战手册。

一、ApoB100的生物学意义：

ApoB100是由4536个氨基酸组成的单链多肽，分子量约550 kDa，是目前已知一级结构最大的蛋白质之一。肝脏合成后，ApoB100像“铰链”一样将VLDL、IDL、LDL颗粒铆定在一起，每颗致动脉粥样硬化脂蛋白仅含1分子Apo100，因此其血浆浓度直接反映“坏胆固醇”颗粒数量，比LDL-C更能预测心血管事件风险。在大鼠模型中，虽然自发斑块罕见，但通过高脂饮食、LDL受体敲除或PCSK9过表达，可诱导高ApoB100血症，模拟人类脂质紊乱的全过程。精准测定ApoB100，是验证造模成功、评价干预手段的金标准。

二、技术原理：双抗体夹心ELISA的“三步锁”

主流试剂盒均采用“固相捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体-链霉亲和素-HRP”四级放大体系，具体步骤如下：

1.捕获：微孔板预包被高亲和鼠抗大鼠ApoB100单克隆抗体，可识别氨基酸序列129–301区段，与ApoB48、ApoE、ApoA1无交叉。

2.结合：标准品或样本中的ApoB100被“锚定”后，加入生物素标记的第二株抗体，识别抗原表位415–588，形成夹心复合物。

3.信号：链霉亲和素-HRP以1:4摩尔比结合生物素，催化TMB显色；450 nm吸光度与ApoB100浓度呈4参数Logistic曲线关系，检测范围7.8–500 ng/ml，灵敏度1.95 ng/ml，可覆盖正常大鼠（20–80 ng/ml）及高脂模型（200–400 ng/ml）全区间。

三、试剂盒组成与保存：细节决定成败

以96T规格为例，完整组件包括：

-预包被板：12条×8孔，铝箔真空包装，4℃保存6个月；开封后未用完条带需立即放入自封袋加干燥剂，一周内用完。

-标准品：重组大鼠ApoB100冻干粉（500 ng/瓶），使用前以500µl样品稀释液复溶，静置10 min后颠倒混匀，避免剧烈涡旋导致蛋白聚集。

-检测抗体：生物素标记IgG，100×浓缩，需当日稀释当日用完；稀释后若出现絮状沉淀，37℃水浴5 min即可复溶。

-SA-HRP：同样100×浓缩，避免反复冻融；冻融超过3次信号衰减>15%。

-底物与终止液：TMB单组分溶液，避光2–8℃保存；终止液为2 M硫酸，具有强腐蚀性，需在通风橱中佩戴护目镜操作。

四、大鼠载脂蛋白B100试剂盒标准操作流程：从“采血”到“出数”的2.5小时

1.样本采集

雄性SD大鼠禁食12 h，眼眶后静脉丛取血，室温静置1 h，4℃1000 g离心15 min，分离上层血清；若需长期保存，分装后–80℃冻存，避免反复冻融导致ApoB100降解。溶血样本Hb>2 mg/ml会显著升高背景，应弃用。

2.稀释优化

预实验阶段建议做2、5、10、20倍系列稀释，选取落在标准曲线中段（50–250 ng/ml）的稀释倍数作为正式条件；高脂血症模型通常需10–20倍稀释，正常对照5倍即可。

3.加样与孵育

每孔先加100µl标准品或稀释样本，设双复孔；37℃温育60 min，期间禁止晃动托盘，防止边缘效应。

4.洗涤

采用“两浸三洗”法：自动洗板机设置350µl/孔，浸泡30 s，洗涤3次；最后一次拍干残余液体，防止稀释底物浓度。

5.显色与终止

加入TMB 100µl，20–25℃避光反应15 min；当最高标准孔A450≈2.0时，立即加入50µl终止液，颜色由蓝变黄。

6.读数与拟合

酶标仪双波长450/630 nm校正，扣除空白孔后，采用4-Parameter Logistic（4PL）拟合，R²≥0.9900视为合格；样本浓度=计算值×稀释倍数。

五、性能验证：数据才是硬通货

-精密度：批内CV 4.2–6.8%，批间CV 8.9–11.5%，符合<15%的行业标准。

-回收率：在已知浓度样本中加入50、150、300 ng/ml标准品，回收率91–108%，平均98.7%。

-特异性：与鼠ApoB48、ApoE、ApoA1、小鼠ApoB100交叉反应率均<0.1%，确保大、小鼠样本通用。

-稳定性：37℃加速7天，信号衰减<10%；–20℃冻融5次，标准曲线斜率下降<8%，满足长途运输及多中心项目需求。

六、大鼠载脂蛋白B100试剂盒常见问题与解决方案

1.背景高：检查洗涤液是否被污染，建议每瓶开封后7天内用完；延长封闭时间至30 min可显著降低空白孔OD。

2.标准曲线“钩状”下降：提示高浓度HOOK效应，可将样本再稀释2–4倍后复测。

3.板间差异大：同一实验尽量使用同一批次试剂盒；若必须跨批次，需重新绘制标准曲线，不可混用标准品。

4.样本结果“跳孔”：多见于手动加样气泡干扰，建议更换优质吸头，加样时倾斜贴壁缓慢释放液体。